Topmusicanswers
Odpravljanje težav z ojačanjem PCR in RT-PCR
| Problem | Možen vzrok |
|---|---|
| Brez trakov na gelu | Podaljšanje je bilo prekratko |
| Toplotni cikel ni imel ustrezne temperature | |
| Dodatni, nespecifični trakovi na gelu | Primeri so hibridizirani na sekundarno mesto v predlogi |
| Kontaminacija DNA je bila vnesena v temeljne premaze ali pufre |
- Kaj povzroča neuspeh PCR?
- Kako odpravite težave s PCR?
- Kaj bi storili, če PCR amplifikacija vzorca ne bi uspela?
- Kaj se zgodi, če PCR dodate preveč primerja?
Kaj povzroča neuspeh PCR?
Običajno prva stvar, ki jo naredijo raziskovalci, je, da ob neuspelem poskusu krivijo okvarjen encim ali reagent, toda s PCR je to dejansko manj verjetno vzrok za neuspeh. Pogosteje so vzrok globlji notranji problemi, kot so zasnova temeljnega premaza, parametri termociklerja ali nespecifična vezava na druga zaporedja šablon.
Kako odpravite težave s PCR?
Preverite sposobnost dolžine amplifikacije izbranih DNA polimeraz. Uporabite DNA polimeraze, posebej zasnovane za dolgotrajno PCR. Izberite DNA polimeraze z visoko procesivnostjo, ki lahko v krajšem času okrepijo dolge tarče. Zmanjšajte temperature žarjenja in podaljšanja, da pomagate pri vezavi temeljnega premaza in termostabilnosti encimov.
Kaj bi storili, če PCR amplifikacija vzorca ne bi uspela?
Če reakcija pomnoževanja ne uspe in sumite, da je predloga DNK kontaminirana z zaviralcem, dodajte sumljivo pripravo DNK v kontrolno reakcijo z vzorcem DNK in parom premazov, ki se je v preteklosti dobro pomnožil .
Kaj se zgodi, če PCR dodate preveč primerja?
Uporaba višjih koncentracij premazov ima lahko naslednje učinke: Če so premazi sposobni tvoriti dimerje, zvišanje njihove koncentracije povzroči le nastanek primer-dimerjev in ne izboljša ojačitve želenega produkta PCR.
