Težave z ojačanjem

1. Kakšne težave lahko nastanejo zaradi amplifikacije PCR?
2. Zakaj pri PCR ni ojačanja?
3. Kaj povzroča amplifikacijo pri PCR?
4. Kaj povzroča neuspeh PCR?

Kakšne težave lahko nastanejo zaradi amplifikacije PCR?

Mnoge pogoste težave s PCR in RT-PCR so odkrite med elektroforezo reakcijskih produktov v agaroznem gelu. Ti vključujejo odsotnost pričakovanega produkta ojačanja, prisotnost nespecifičnih produktov, pretirano razmazovanje in prisotnost pasu "primernega dimerja".

Zakaj pri PCR ni ojačanja?

Encim DNA polimeraze ne deluje

Encim DNA polimeraze je odgovoren za razširitev vezanih primerjev vzdolž vzorcev DNA. Če ta encim ni več tako učinkovit, morda zaradi zamrzovanja in odmrzovanja, bo podaljšani korak med reakcijo PCR nepopoln, zato ne boste imeli PCR produkta.

Kaj povzroča amplifikacijo pri PCR?

Osnovna PCR. Postopek PCR je bil prvotno razvit za ojačanje kratkih segmentov daljše molekule DNA (Saiki et al. 1985). Tipična reakcija amplifikacije vključuje ciljno DNA, termostabilno DNA polimerazo, dva oligonukleotidna primerja, deoksinukleotid trifosfate (dNTP), reakcijski pufer in magnezij.

Kaj povzroča neuspeh PCR?

Običajno prva stvar, ki jo naredijo raziskovalci, je, da ob neuspelem poskusu krivijo okvarjen encim ali reagent, toda s PCR je to dejansko manj verjetno vzrok za neuspeh. Pogosteje so vzrok globlji notranji problemi, kot so zasnova temeljnega premaza, parametri termociklerja ali nespecifična vezava na druga zaporedja šablon.